سیستم همکاری در فروش سپیده

هدف از اين تحقيق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است. بنابراين پس از جداسازي و تكثير ژنهاي فوق مراحل زير در اين تحقيق انجام گرفت.

1    لكون نمودن ژنهاي فوق در يك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2    تعيين ترادف نوكلئوتيدي ژنهاي جداشده و مقايسه آن با ژنهاي L7/L12

3    كلون نمودن ژنها در پلاسميد بيان كننده پروكاريوني Procaryotic expression vector

4    توليد و تخليص پروتئينهاي L7/L12 و P39

5    كلون نمودن آنها در پلاسميد بيان كننده اوكاريوتي Eucaryotic expression vector

6    هاري كردن پلاسميدهاي فوق از آندوتوكسين

7    تزريق پلاسميدها، بسويه واكنش و سويه بيماريزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8    سنجشهاي ايمونولوژيك

باكتريها و پلاسميدهايي كه براي انجام اين پايان نامه استفاده دشه اند بترتيب زير مي باشند

باكتريها بروسلاآبورتوس سويه هاي 19S و 544 اشديشيالكي سويه

اشريشيالكي سويه BL21     اشريشياكي سويه BL21(DE3(Plyss

پلاسميرها PGEX4T1     PRT 28a     SK+(pSK)     Pblue Script   PCDNA3

جداسازي كروموزوم بروسلا آبورتوس 19S

براي تكثير ج داسازي ژنهاي L7/L12 و P39 ابتدا كروموزوم باكتري جداسازي گرديد.

مواد

بافر TE

Tris     Hel                    10mm

EDTA               1.0mm

‍PH بافر را پس از تهيه برروي 8 تنظيم مي نمائيم.

پروتئيناز K

CTAB/NaCl

Nacl                             4.1gr

CTAB               10gr

DDW                            100ml (Final Volume)

روش

ابتدا محيط برنسط برات را تهيه و استريل نموده و ml5 از محيط را با بروسط آبورتوس سويه 19S تلقيح مي نمائيم. پس 48 تا 72 ساعت باكتريها رشد كرده و كدورت مناسبي را پيدا مي كند. بقيه مراحل تخليص كروموزوم بشرح زير است

1    5/1 ميلي ليتر از سوسپاستيون فوق را مدت 2 دقيقه در rpm5000 سانتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را دور مي ريزيم.

2    Ml576 از بافر TE را بر روي رسوب باكتري اضافه كرده و رسوب را در بافر حل مي نمائيم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئيناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت يكساعت در دماي 0C37 نگهداري مي نمائيم.

3    پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بميزان Ml80 اضافه كرده و بمدت 10 دققيق در  0C65 انكوبه مي كنيم.

4    هم حجم مخلوط بالا از تركيب كلروفرم     ايزوآميل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقيقه در rpm10000 سانترفوژ مي كنيم. محلول رويي را به لوله ديگر منتقل مي نمائيم.

5    هم حجم محلول روئي ترميب فنل     كلروفرم     ايزوآميل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقيقه در vpr10000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي به لوله ديگري منتقل مي نمائيم.

6    هم حجم محلول روئي ايزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط مي كنيم. پس از چند دقيقه DNA كروموزومي ته نشين شده كه مي توان بات يك پيپت پاستور آنرا جمع آوري نمائيم.

7    رسوب DNA كروموزومي را با الكل 70% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل مي نمائيم.

بررسي كمي و كيفي DNA كروموزومي

براي تعيين خلوط كروموزوم باكتري از مواد و وسايل زير استفاده ميشود.

1    بافر PBE   pH=8(10X)

Tris     base                                          890mM

Boric Acid                                            890mM

EDTA                                       25mM

2    آگارز MP

3    تانك الكتروفورز افقي

روش

ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بكمك حرارت حل كرده و ژل آگارز افقي را سيني مخصوص تانك الكتروفورز افقي تهيه مي نمائيم. سپس به مقدار Ml5 از DNA كروموزومي را در چلهك ژل ساخته شده ريخته و در تانك الكتروفورز حاوي بافر TBE(0.5x) پس از برقراري جريان الكتريكي مستقيم الكتروفورز مي كنيم.

بريا تعيين مقدار DNA نيز پس از تهيه رقت

 تز كروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گيري مي نمائيم. مقدار DNA بر اساس فرمولعكس رقت

 50

 DD قرائت شده = مقدار DNA تعيين مي گردد.

    مرحله پس از جداسازي كروموزوم تكثير و جداسازي ژنهاي مورد نظر است. اين فرآيند با استفاده از دستگاه PCR انجام مي گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پايه اي، ژن مورد نظر را مي توان با استفاده از آنزيم تك پلي مرآز Tag Polymerase تكثير نمود. عوامل پايه اي ذكر شده شامل موارد ذيل است.

1    قالب

2    پرايمر جلو Forward

3    پرايمر عقب Revers

4    دروكسي نوكلئوتيدها LNTP

5    منيزيوم

6    بافر

7    آنزيم پلي مرآز

8    آب مقطر استريل

براي تهيه پرايمرها ابتدا بايد آنها را طراحي كرد. براي طراحي پرايمرهاي ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوكلئوتيدي ژنهاي فوق را از مركز اطلاعاتي NCBI بدست مي آوريم.

accession No(L7/L12). L27819

accession No(P39). L35038

سپس بر اين اساس و درنظر گرفتن نكات استاندارد طراحي پرايمر از جمله طول پرايمر، دماي اتصال G+C%، توليد پرايمر، توليد لوپ يا حلقه و … ترادف پرايمرهاي تعيين ميگردد. در اين مرحله از آناليزهاي كامپيوتري توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده ميگردد.

ترادف ژن مورد نظر و پرايمرهاي Forward و Reverse براي جداسازي ژنهاي فوق از باكتري بروسلا به شرح زير است

پرايمرهاي L7/L12

Forward

5’ GGA AAT

GCT GAT CTC GCA AA3’

Revers

5’ CCA 

  CTT  GAG  TTC AAC XTT   GGC  CA3’

2    پرايمرهاي P39

Forward

5’ GCC  

GGC   GCC   TGT   TGC   CAA 3’

Reverse

5’ C CGC 

TTT  TGC   GGC   TTC   AA  3’

جهت سهولت مراحل كلونينگ و با توجه به محلهاي ممكن براي كلون سازي در پلاسميدهاي حد واسط و پلاسميدهاي بياني دو جايگاه آنزيمي BamHI و XhoI درابتدا و انتهاي پرايمر طراحي شده است. پرايمرهاي طراحي شده توسط شركت MWG آلمان ساخته شد.

براي انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. براي بهينه سازي تكثير ژنهاي ذكر شده غلظتهاي مختلف يون منيزيم (از 5/1 تا 5/3 ميلي مولار) و دماهاي مختلف مناسب براي اتصال پرايمرها با DNA كروموزومي (66   63 درجه سانتيگراد) بكار رفته است.

    تائيد ژنوم سنتز شده توسط PCR

براي تاييد صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزيمي ژنهاي فوق استفاده مي گردد. چنانچه از هضم آنزيمي ژن L7/L12 با آنزيمهاي EC0RI و Hind III بترتيب قطعات (168+206) و (305+69) بايد ديده شود و از هضم آنزيمي ژن P39 با آنزيمهاي NEOL و Hind III بترتيب قطعات (136+560+709) و (553+652) بايد ديده شود.

براي تاييد نهايي صحت ژنهاي تكثير شده از نظر ماهيت و ترادف نوكلئوتيدي آنها، اين ژنها ابتدا در ناقل pSK+ كلون گرديد و سپس براي تعيين سكانس به شركت مربوط ارسال گرديد.

    كلونينگ ژنهاي L7/L12 و P39 در كلونينگ pSK+

براي كلونينگ ژنهاي فوق ابتدا بايد ژنها تحت اثر آنزيمهاي BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسميدي pSK نيز با آنزيمهاي اخير برش داده شود.

1    برش آنزيمي ژنهاي L7/L12 و P39 با آنزيمهاي BamHI و xhoI.